Внутрішньолабораторна валідація методу визначення видової приналежності м’яса за використання ПЛР-рч тест-системи «М’ясо-тест»

Abstract

Проведено процедуру внутрішньолабораторної валідації методу визначення видової приналежності м’яса згідно з європейськими стандартами та нормами. Процедуру валідації проводили за використання розробленої тест-системою «М’ясо-тест» на основі TaqMan-технології методу ПЛР у реальному часі. Даний діагностикум дозволяє здійснювати ідентифікацію видової належності тваринних тканин у м’ясній сировині, подрібненій сировині у складі м’ясних напівфабрикатів, готових необроблених м’ясних виробах та тих, що зазнали термічної обробки. Тест-систему виконано у форматі мультиплексу та вона дозволяє одночасно ідентифікувати три мішені – курятину, свинину та яловичину. Валідацію методу проводили за такими основними параметрами, як специфічність, межа виявлення, аналітична чутливість, ефективність ампліфікації та лінійність. Специфічність методу становила 100% за всіма трьома каналами – Fam (курятина), Hex (свинина) та Rox (яловичина). Перехресних реакцій при цьому виявлено не було. В межах робочого діапазону (Ct ≤ 39) хибно-негативних та хибно-позитивних результатів не спостерігалося, що засвідчувало високий рівень застосованого методу. Межа виявлення та аналітична чутливість для каналів Fam та Hex становили 1×10-6 та 1×10-5 нг, відповідно. Для каналу Rox межа виявлення становила 1×10-7 нг, а аналітична чутливість – 1×10-6 нг. Отримані значення нахилу калібрувальних кривих (α) вкладалися в діапазон від –3,58 до –3,10, що свідчило про задовільну ефективність ампліфікації. Розраховані значення ефективності ПЛР для каналів Fam, Hex, Rox склали 103,2, 100,0 та 94,9 %, відповідно, що є досить високим показником для діагностичних тест-систем. Також було показано чітку залежність значень Ct досліджуваних зразків від логарифму початкової концентрації внесеного субстрату (R2 ≥ 0,98). Отримані параметри валідації відповідають стандартам ЄС щодо проведення ПЛР аналізу та дозволяють застосовувати дану методику в лабораторній практиці. Даний підхід може бути рекомендований випробувальним лабораторіям для забезпечення максимального ступеню вірогідності одержаних результатів та позбавлення аналітичних помилок, що призводять до виникнення хибно-позитивних та хибно-негативних результатів.

Intralaboratory validation of meat-species identification method was performed according to european standards and regulations. Validation was performed by designed test-system «Meat-test» on the basis of TagMan technology Real-Time PCR.This test-system allows to perform species-specific identification of animal tissues in meat raw material, grinded up meat raw material in the content of semi-finished meat products, finished untreated meat products, and meat products under thermal treatment. Test-system id designed as multiplex and it allows to identify three targets-chicken, pork and beef, simultaneously. Method validation was performed for such basic parameters as specificity, limit of detection, analytical sensitivity, amplification efficiency and linearity. Method specificity was 100% for all three indicators – Fam (chicken),Hex (pork), and Rox (beef). No cross reactions was detected. No false-negative and false-positive results was detected, what shows high level of applied method. Limit of detection and analytical sensitivity for Fam and Hex was 1×10-6 and 1×10-5 ng, respectively. Limit of detection was 1×10-7ng, and analytical sensitivity was 1×10-6 ng for Rox. Obtained values of slope of calibration curves (α) were within –3,58 to –3,10,what shows normal amplification efficiency. Calculated PCR efficiency values for Fam, Hex, Rox, was 103,2, 100,0 and 94,9 %, respectively, what is high enough value for diagnostic test-system. Clear dependence of analysed samples Ct values on logarithm of initial concentration of added substrate was shown (R2 ≥ 0,98). Obtained validation parameters meet the EU PCR-performing standards. It enables application of this method in laboratory practice. This approach can be recommended to test laboratories for high reliability implementation of obtained results and analytical errors (false-positive and false-negative results) elimination.

Проведена процедура внутрилабораторной валидации метода определения видовой принадлежности мяса согласно европейским стандартам и нормам. Процедуру валидации проводили с помощью разработанной тест-системы «Мясо-тест» на основе TaqMan-технологии метода ПЦР в реальном времени. Данный диагностикум позволяет осуществлять идентификацию видовой принадлежности тканей животных в мясном сырье, измельченном сырье в составе мясных полуфабрикатов, готовых необработанных мясных изделиях, а также тех, что подверглись термической обработке. Тест-система выполнена в формате мультиплекса и позволяет одновременно идентифицировать три мишени – курятину, свинину и говядину. Валидацию метода проводили по таким основным параметрам, как специфичность, предел обнаружения, аналитическая чувствительность, эффективность амплификации и линейность. Специфичность метода составляла 100% по всем трем каналам – Fam (курятина), Hex (свинина) и Rox (говядина). Перекрестных реакций при этом выявлено не было. В пределах рабочего диапазона (Ct ≤ 39) ложно-отрицательных и ложно-положительных результатов не наблюдалось, что свидетельствовало о высоком уровне примененного метода. Предел обнаружения и аналитическая чувствительность для каналов Fam и Hex составляли 1×10-6 и 1×10-5 нг, соответственно. Для канала Rox придел обнаружения составлял 1×10-7 нг, а аналитическая чувствительность – 1×10-6 нг. Полученные значения угла наклона калибровочных кривых (α) вкладывались в диапазон от –3,58 до –3,10, что свидетельствовало об удовлетворительной эффективности амплификации. Рассчитанные значения эффективности ПЦР для каналов Fam, Hex и Rox составили 103,2, 100,0 и 94,9 %, соответственно, что является довольно высоким показателем для диагностических тест-систем. Также была показана четкая зависимость значений Ct исследуемых образцов от логарифма начальной концентрации внесенного субстрата (R2 ≥ 0,98). Полученные параметры валидации отвечают стандартам ЕС по проведению ПЦР анализа и разрешают применять данную методику в лабораторной практике. Данный подход может быть рекомендован испытательным лабораториям для обеспечения максимального уровня достоверности полученных результатов и избеганию появления аналитических ошибок, которые могут приводить к возникновению ложно-положительных и ложно-отрицательных результатов.